IF18,9| RayBio多因子检测抗体芯片帮助治疗心肌梗死的3D高功能复合型心肌类器官进行功能性验证

心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是一种严重的心脏疾病，其高发病率和死亡率给全球公共卫生带来了巨大挑战。目前，尽管有药物治疗、介入治疗等多种手段，但心肌梗死后心脏功能的恢复仍然是一个难题。组织工程和再生医学的兴起为心肌梗死的治疗提供了新的思路。其中，利用人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs）和人间充质干细胞（如人脂肪来源的间充质干细胞，human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs）进行心脏组织修复和再生是研究的热点之一。

hiPSC-CMs具有自我更新和分化为心肌细胞的潜能，为心肌梗死的细胞治疗提供了理想的细胞来源。然而，单独使用hiPSC-CMs进行移植存在一些问题，如免疫排斥、细胞留存率低以及心功能改善有限等。而hADSCs具有免疫调节、促进血管生成和心肌细胞成熟的作用，这些特性使其成为与hiPSC-CMs联合应用的理想候选细胞。

日本大阪大学研究团队通过共培养hiPSC-CMs和hADSCs，构建了一种具有复合功能的3D心脏组织片层，以提高心肌梗死后心脏功能的恢复效果。

研究方法

研究思路

本研究通过将hiPSC-CMs和hADSCs共培养在PLGA纤维支架上，构建一种复合三维心脏组织片。首先，通过体外实验评估组织片的厚度、细胞排列、ECM沉积、收缩能力和旁分泌功能。然后，将组织片移植到大鼠心肌梗死模型中，评估其对心脏功能的改善效果，包括心脏收缩功能、纤维化程度和血管生成情况。

 具体方法

PLGA纤维支架的构建：使用电纺丝技术制备PLGA纤维支架，并通过扫描电子显微镜（SEM）观察纤维结构。

hiPSC-CMs的诱导与表征：从hiPSCs诱导分化为hiPSC-CMs，并通过流式细胞术和免疫荧光染色验证其心肌细胞特性。

hADSCs的培养与表征：从人脂肪组织中分离hADSCs，并通过流式细胞术和分化实验验证其间充质干细胞特性。

组织片的构建：将hiPSC-CMs和hADSCs按9:1的比例共培养在PLGA纤维支架上，形成三维心脏组织片。

体外功能评估：

厚度和细胞排列：通过H&E染色评估组织片的厚度和细胞排列。

收缩能力：使用高速摄像系统评估组织片的收缩速度和变形距离。

线粒体功能：通过Seahorse线粒体压力测试评估组织片的氧消耗率（OCR）。

旁分泌功能：通过raybiotech的细胞因子抗体芯片和ELISA检测组织片分泌的血管生成相关因子（如VEGF、HGF、bFGF）。

体内治疗效果评估：

心脏功能评估：通过超声心动图评估大鼠心脏的左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）。

纤维化和梗死面积评估：通过Masson染色和天狼星红染色评估心脏纤维化和梗死面积。

血管生成评估：通过免疫荧光染色评估新生血管和动脉密度。

hiPSC-CMs和hADSCs的表征

在第14天进行流式细胞术分析，心肌肌钙蛋白T（cTnT）阳性细胞的百分比为90.2±1.6%（fig.1B）。免疫荧光染色显示，hiPSC CMs表达α-肌动蛋白和cTnT（fig.1C和D），表明心肌细胞（CMs）具有排列良好、清晰的肌节结构。此外，N-钙粘蛋白和连接蛋白43（Cx43）的免疫荧光染色揭示了hiPSCMs之间的细胞间通讯和间隙连接（fig.1C和D）。这些结果表明，hiPSCs成功分化为高纯度功能CM。

为了确认hADSCs的特征，进行了基于流式细胞术的分析，结果显示，hADSCs高度表达CD73、CD90和CD105，而CD31、CD34、CD45、HLA-G和HLA-DR表达较低。

 

CM和CM+ADSC复合组织片的构建与评估

研究者采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纤维支架作培养基质，以促进hADSCs和hiPSC-CMs的组织形成，结果发现，复合组织片厚度为231.00 ± 15.14 μm，比单独培养的hiPSC-CMs组织片（185.52 ± 16.02 μm）更厚。TUNEL染色显示，CM + ADSC组织片的细胞凋亡率低于CM组织片。免疫荧光染色显示，CM + ADSC组织片中hiPSC-CMs的排列更加整齐，且细胞外基质（ECM）的表达更为丰富（fig. 2）。

 

CM和CM+ADBC组织片的收缩和呼吸特性

通过高速相机运动分析系统对CM+ADSC组织片的收缩性能进行了评估。结果显示，CM + ADSC组织片的收缩速度、放松速度和加速度显著高于CM组织片。CM + ADSC组织片的收缩变形距离和放松变形距离也显著更长。此外，微电极阵列（MEA）记录的电生理记录显示，CM + ADSC组织片的传导速度与CM组织片无显著差异。使用Seahorse XF细胞线粒体应激测试，CM + ADSC组织片的最大呼吸能力显著高于CM组织片，表现出更强的线粒体功能方面均优于CM组织片（fig. 3）。

CM和CM+ADBC组织片的细胞因子分泌和血管生成功能

使用人细胞因子抗体芯片C5检测发现，CM+ADSC组织片的培养上清液中多种细胞因子（如CXCL5、GRO、CXCL1、IL-6、IL-8、CCL8、CCL7、CCL5、SDF-1、血管生成素、VEGF-A、HGF、MIP-3α、SPP-1和TNFRSF11）的丰度显著高于CM组织片。进一步通过ELISA定量分析发现，CM+ADSC组织片上清液中VEGF、HGF和bFGF的浓度也显著高于CM组织片（fig.4）。

 

此外，使用人血管生成抗体芯片C1000检测发现，CM+ADSC组织片上清液中多种与血管生成相关的细胞因子（如血管生成素、GRO、IL-6、IL-8、CCL5、TIMP-1、TIMP-2、VEGF-A、ANGPT1、ANGPT2、CCL7、MMP-9和uPAR）的丰度更高。体外试管形成实验显示，CM+ADSC组织片的上清液显著增强了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成能力，其网格数、分支数和管子总长度均显著高于CM组织片（fig. 5）。这些结果表明，CM+ADSC组织片在细胞因子分泌和血管生成方面表现出显著的增强效果，尤其是在分泌与血管生成相关的旁分泌因子方面。

CM+ADBC组织片体内移植效果

为了进一步研究CM+ADCC组织片的治疗效果，研究者通过在大鼠心肌梗死模型中移植CM组织片和CM+ADSC组织片，评估它们对心脏功能的改善效果。在移植前（-2周）和移植后1、2、3、4周，通过超声心动图检测了左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）。结果显示，在移植后第1、2、3、4周，CM+ADSC组织片组的LVEF和LVFS值显著高于CM组织片组和心肌梗死（MI）组（fig. 6），表明CM+ADSC组织片在促进心肌梗死后心脏功能恢复方面具有显著的治疗效果。

CM+ADBC组织片移植可抑制肥大，促进hiPSC-CM移植物植入

研究者在移植后4周，通过对四组大鼠心脏样本进行HE染色和WGA染色，发现MI组的心肌细胞（CMs）平均直径显著大于Sham组，表明心肌肥大现象明显。然而，CM+ADSC组和CM组的心肌细胞平均直径显著小于MI组，说明组织片移植能够抑制心肌肥大。免疫荧光染色结果显示，CM+ADSC组的移植物保留率更高（4/8大鼠），且移植物内的hiPSC-CMs密度更高、排列更整齐。此外，CM+ADSC组移植物中的vWF阳性细胞和α-SMA阳性细胞数量多于CM组，表明其血管生成能力更强（fig. 7）。这些结果表明，CM+ADSC组织片移植能够有效抑制心肌肥大，增强移植物的保留和内部血管生成。

CM+ADBC组织片移植可减少宿主心脏纤维化，促进血管生成

为了研究心脏功能改善的潜在机制，研究者通过Masson染色和Sirius Red染色检查了心脏纤维化的程度。在移植后4周，发现CM+ADSC组的纤维化面积显著低于CM组，而CM组的纤维化面积也显著低于MI组（fig. 8A和B）。同样，CM+ADSC组的梗死面积也显著小于CM组和MI组（fig. 8C和D）。此外，通过免疫荧光染色评估宿主心肌梗死边缘区的新生血管形成，结果显示CM+ADSC组的新生血管密度和小动脉密度均显著高于CM组和MI组，表明CM+ADSC组织片在预防心脏纤维化和促进血管生成方面具有显著效果。

研究结论

本研究成功开发了一种由hiPSC-CMs和hADSCs组成的复合功能性组织片（CM+ADSC），并证明其在体外和体内对心肌梗死的治疗潜力。CM+ADSC组织片在组织结构、收缩性能、细胞因子分泌和血管生成方面均表现出显著优势，显著改善了心肌梗死大鼠模型的心脏功能，减少了纤维化，并促进了新生血管的形成。这些发现为开发新型心肌梗死治疗策略提供了有力的科学依据。未来的研究应进一步探索其临床应用的可行性和安全性。

 

文献：Zhang J, Li J, Qu X, Liu Y, Sun L, Harada A, Hua Y, Sougawa N, Tabata A, Liu L, Miyagawa S. Development of composite functional tissue sheets using hiPSC-CMs and hADSCs to improve the cardiac function after myocardial infarction. Bioactive Materials. 2024 Jul 1;37:533-48.