杂志名称：Advanced Science

影响因子：15.444

文献题目：Mouse Modeling Dissecting Macrophage–Breast Cancer Communication Uncovered Roles of PYK2 in Macrophage Recruitment and Breast Tumorigenesis

第一作者：Anna-Katharina Müller

通讯作者：Sima Lev

作者单位：Molecular Cell Biology Department Weizmann Institute of Science Rehovot 76100, Israel

本实验所用产品：80 Human Cytokines: AAH-CYT-G5; RayBiotech

实验样品：细胞上清
 

研究背景：
乳腺肿瘤中的巨噬细胞浸润与增强的肿瘤进展、转移和不良临床结果相关，并被认为是治疗干预的目标。通过使用不同的遗传小鼠模型，作者表明，切除酪氨酸激酶PYM2，无论是在乳腺癌细胞、肿瘤微环境，或是在两者中，都显着减少了浸润性肿瘤巨噬细胞的数量，同时抑制了肿瘤血管生成和肿瘤生长。.引人注目的是，仅在巨噬细胞中切除PYK2足以诱导类似的效果。这些表型变化与单核细胞募集减少和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的大量减少有关。从机制上讲，研究人员表明PYK2通过对介导乳腺癌细胞和巨噬细胞关键受体信号传导起到关键作用。具体来说，PYK2切除抑制Motch1信号传从而减少乳腺癌细胞分泌CCL2，同时降低巨噬细胞中CCR2、CXCR4、IL-4R𝜶和Stat6的活化水平。这些双向效应调节单核细胞募集、巨噬细胞极化和肿瘤血管生成。PYK2的表达与乳腺癌患者中浸润的巨噬细胞相关，其对巨噬细胞浸润和促肿瘤表型的影响提示PYK2靶向治疗可作为一种调节TAMs的有效策略，并可能使乳腺癌对免疫治疗敏感。


结果：

1. 1. PYK2调节TAM浸润和乳腺癌生长

研究团队通过使用不同的基因小鼠模型，将野生型（WT）和PYK2敲除型（KO）乳腺癌（BC）细胞分别原位植入WT或PYK2ko/KO（PYK2 KO）C57BL/G小鼠，发现非受体酪氨酸激酶PYK2的缺失显著降低了乳腺肿瘤中巨噬细胞的数量。

1. 1. 剖析PYK2缺乏对乳腺癌细胞和TME的独特影响

研究团队为了进一步探索PYK2-KO减少TAM数量，从而抑制其促肿瘤作用并减弱BC生长的可能性，通过不同的小鼠模型系统比较WT和植入WT小鼠的PYK2 KO EO771细胞的肿瘤生长，结果发现在BC细胞或TME中切除PYK2可显著减少TAM数量，表明PYK2是单核细胞/巨噬细胞吸引所必需的,以及PYK2有效和选择性抑制剂的治疗潜力。

1. 1. 切除乳腺癌细胞PYK2可损害CCL2分泌、 NOTCH1信号转导以及巨噬细胞募集的影响

研究团队用Transwell分析法进一步研究了BC细胞中PYK2的缺失显著减弱巨噬细胞对肿瘤细胞的趋化性，结果表明PYK2的缺失调节癌细胞的分泌体，从而调节巨噬细胞的吸引力。紧接着，为了鉴定相关的分泌因子，研究团队使用细胞因子芯片(80个人细胞因子: AAH-CYT-G5; RayBiotech)分析了WT和PYK2缺失的人BT549和MDA-MB-231细胞（图3 C），结果显示，参与单核/巨噬细胞募集的几种细胞因子在两个PYK2缺失的TNBC细胞系的上清液中显著减少，如IL-1𝛽 和其他趋化因子（CCL2、CXCL7、CCL7、CCL15）至少在BT549中显著降低。由于CCL2是在大多数实体瘤的单核细胞募集中起主要作用，并用ELISA验证（图3 D和E）进一步证实了该趋化因子的结果。（图3G-I）表明了PYK2对CCL2转录的影响，通过WB评估了NOTCH1和N1ICD，发现PYK2通过NOTCH1途径稳定N1ICD的蛋白水平（图4 A-C）来调节BC细胞中CCL2的转录，进一步证实BC细胞系中Notch1和CCL2之间的联系。

 

1. 1. 仅在巨噬细胞中切除PYK2足以减少肿瘤生长和巨噬细胞浸润

为了进一步阐明PYK2和TAM之间的功能联系，研究团队建立了巨噬细胞特异性PYK2-KO小鼠(简称 mφ-KO)，与 Mφ-WT 小鼠相比，Mφ-KO小鼠的肿瘤生长明显减少，24 天后平均减少 38% (图 5e)。通过 H&E 染色肿瘤没有观察到明显的显微镜变化证明了 TAMs 对肿瘤生长的显著影响，以及PYK2在巨噬细胞-乳腺癌信号中起到关键作用。

1. 1. PYK2基因敲除巨噬细胞的缺陷

如图5所示，选择性切除巨噬细胞中的PYK2可显著抑制肿瘤生长并同时降低TAM数量，这意味着切除巨噬细胞中的PYK2可导致细胞自主缺陷或损害其与肿瘤细胞的串扰。因此研究团队通过改良的Boyden小室迁移实验研究了巨噬细胞中PYK2切除对细胞移行的影响，并对WT和PYK2 KO BMDM的RNA序列数据进行了基因集富集分析（图6D），进一步证实PYK2缺失损害了向CCL2的迁移，结果强调了PYK2通过同时影响乳腺癌细胞CCL2释放和巨噬细胞CCR2蛋白水平来调节CCL2-CCR2信号的双重作用。

 

1. 1. PYK2 调节巨噬细胞中的IL-4R信号传导并影响其促肿瘤发生表型

RNA序列分析表明，IL-4通路在PYK2-KO-BMDM中发生了显著改变（图6D和7A），为了验证PYK2对这一途径的影响，研究团队检测了IL-4受体(IL-4R)和IL-4R途径下游效应PSTAT6的水平，以及对照组和PYK2 KO Raw264.7和BMDMs组的水平，并对PYK2 KO巨噬细胞的进一步分析,结果显示巨噬细胞中PYK2的切除也降低了IL-4R的水平，IL-4R是促肿瘤发生极化所必需的主要受体，并强有力地降低了Stat6的活化。因此，Stat6靶基因的转录减少，导致较少的促肿瘤生成TAMs，减少血管生成和肿瘤生长。

1. 1. PYK2 切除减少肿瘤血管生成

研究团队发现癌细胞或巨噬细胞中PYK2的缺失降低了几种促血管生成因(VEGFA、IL1B、 IL6、TYMP和PLAU)的mRNA表达(图 8)， 提示PYK2可通过多种机制调节肿瘤血管生成，其在BC细胞和TME中的切除可降低某些促血管生成因子的水平，减弱肿瘤血管生成。

结论：
研究团队通过使用细胞因子芯片(80个人细胞因子: AAH-CYT-G5; RayBiotech)分析发现PYK2的缺失调节癌细胞的分泌因子，包括如IL-1𝛽 和其他趋化因子（CCL2、CXCL7、CCL7、CCL15）其中发现由于CCL2是在大多数实体瘤的单核细胞募集中起主要作用，从而减少乳腺癌细胞分泌CCL2，可同时降低巨噬细胞中CCR2、CXCR4、IL-4R𝜶和Stat6的活化水平；另一方面，通过抗体芯片的使用帮助研究团队在研究中突出了PYK2 对关键信号传导的多效作用，以及调节巨噬细胞募集、极化和致瘤特性，并在后期验证中突出其在癌症治疗中的临床意义起到了关键作用。