RayBiotech 抗体芯片在狼疮性肾炎研究中的应用

杂志名称：JCIinsight

 

影响因子：6

 

文献题目：Integrated urine proteomics and renal single-cellgenomics identify an IFN-γ response gradient in lupus nephritis

 

第一作者：Andrea Fava

 

通讯作者：Andrea Fava

 

作者单位：

Division of Rheumatology, Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore, Maryland, USA.

 

本实验所用产品：

GSH-CAA-X00（可同时检测 1000 个人类细胞因子的半定量玻璃芯片）

 

实验样品：尿液

 

研究背景：

狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮（SLE）最严重的表现之一。狼疮性肾炎影响高达 50% 的患者，导致 10% 的终末期肾病，与一般人群相比，其死亡率增加了 8 倍。由于肾炎通常是无症状的，SLE 患者需要连续筛查是否存在异常尿蛋白。当蛋白尿升高时，进行肾活检以确认诊断并指导治疗。组织病理学分类根据炎症和纤维化的存在、数量和位置将狼疮肾炎分为 6 类。例如，肾小球内免疫细胞浸润（III 类和 IV 类）的存在确定了 SLE 肾炎最具侵袭性的增殖形式，可通过更强的免疫抑制进行治疗。研究表明狼疮性肾炎是一个动态的过程，因此在某一时间点从肾活检推断疾病状态的价值可能有限。最近的单细胞 RNA-Seq 研究揭示了狼疮肾炎中免疫细胞的复杂网络及其多样性。由于具有相同组织学分类的患者可能会有显著不同的结果，因此需要一种新的基于生物学的狼疮肾炎分类方法来分析异质性。前期研究探索了利用靶向和系统蛋白质组学方法评估和预测狼疮肾炎的潜在生物标志物。然而，这些在临床实践尚未被标准化。

 

1 结果

1.1 尿蛋白质组学基于免疫激活梯度对狼疮性肾炎患者分类

这项研究旨在探讨是否可以根据尿液中不同的生物模式对狼疮性肾炎患者进行分类。研究人员对 30 例 SLE 的尿液样本进行 1000 种蛋白质检测。为了确定炎症的模式，研究人员使用了主成分分析（PCA）。如图 1 所示，前两个主成分（PC）根据尿液蛋白的表达不同将健康者与 SLE 患者明确分开。在狼疮性肾炎患者中，第一主成分（PC1）按梯度对患者进行分层（图 2A）。研究人员注意到，PC1 值较高的患者更有可能患有增生性狼疮肾炎，而单纯膜性狼疮肾炎患者的 PC1 值接近 0 或为阴性（图 2A 和 B），这表明 PC1 检测到了许多增生性狼疮肾炎患者共有的生物学反应。接下来，研究人员试图描述 PC1 梯度的生物学意义。PC1 所有蛋白的通路分析显示 PC1 与趋化通路有关（FDR<0.01）（图 2D）。特别是，一种对 IFN -γ，IL-1β 和 TNF 反应，直接吸引单核细胞、NK 细胞和 CD8+T 细胞的趋化因子模式。这些发现表明尿液蛋白组学分析证实了狼疮性肾炎患者特异性免疫激活因子的差异表达及更强信号与增生性狼疮肾炎相关。

 

1.2 尿细胞因子反映髓细胞和细胞毒性淋巴细胞在肾内的产生

研究人员猜测狼疮肾炎患者尿液中的趋化因子是否提示肾内浸润免疫细胞。为了证明这假设，研究人员分析了 24 例狼疮性肾炎患者肾活检的单细胞转录组（图 3A 和 B）。研究人员对肾细胞中尿液 PC1 中 2 条最丰富的途径（「趋化因子介导的信号途径」，GO:0070098；细胞对干扰素 -γ 的反应，GO:0071346）中发现的蛋白质编码基因进行了单细胞转录组学分析（图 4）。趋化因子评分定义为上述基因正常表达的总和。尽管这些趋化因子在大多数浸润性免疫细胞和上皮细胞中表达，但在髓样细胞、NK 细胞和 CD8+T 细胞中观察到显性表达（图 3C-F）。为了评估尿液中发现的蛋白质是否由于肾小球或肾小管损伤而非来源于血清，研究人员校正白蛋白和 β2 - 微球蛋白后重新分析，分析结果几乎与未经调整的分析相同。这些结果表明，尿液蛋白质组学鉴定的趋化因子来源于肾内，尤其是髓样细胞、NK 细胞和 CD8+T 细胞。

 

1.3 所有狼疮性肾炎患者IFN-γ主要由CD8+和NK细胞浸润产生

通路分析显示 IFN-γ、IL-1β 或 TNF 可诱导趋化因子模式。在 3 种细胞因子中，IFN-γ 阳性细胞最多，其次是 TNF 和 IL-1β（图 3G）。IFN-γ 主要由 CD8+T 和 NK 细胞产生；TNF 由髓样细胞、CD8 + 和 CD4+T 细胞产生；IL-1β 几乎完全由髓样细胞产生（图 3B 和 H）。这些细胞因子的局部转录表明它们在肾脏中的转录特征和尿液中的蛋白质水平是肾内产生的直接结果。由于患者对数据库贡献了不同数量的细胞，研究人员评估了这些发现是否有偏差。在所有患者中都发现了 IFN-γ+ 细胞，占总免疫细胞的 4%-45%（平均 18%）；TNF + 细胞占 4%-32%（平均 16%）；IL-1β+ 占 0%-13%（平均 7%）（表 2）。相反，研究人员没有发现任何 1 型 IFN（图 5）或 2 型免疫（Th2）细胞因子的转录如 IL-4、IL-5 或 IL-13（图 6），表明 1 型（Th1）免疫应答在狼疮性肾炎患者中普遍存在的，和 IFN-γ（2 型 IFN）是狼疮性肾病免疫细胞产生的主要 IFN。

 

1.4 尿蛋白质组学可预测肾内细胞浸润        

研究人员假设尿液蛋白质组学可以用来推断狼疮性肾炎肾脏浸润细胞类型的组成。研究人员分析了 6 例患者的尿液蛋白质组学和肾组织单细胞转录组学。其中，4 例患者根据组织病理学诊断为增生性狼疮性肾炎（包括混合性），2 例为单纯膜性狼疮性肾炎（图 7A）。单细胞转录组学显示，不考虑组织病理类型，均存在异质性细胞浸润（图 7B）。研究人员发现尿液蛋白质组学 PC1 值与肾浸润 CD8+T 细胞的丰度（r2=0.84，P<0.01；图 7C）密切相关，而与其他细胞类型无显著相关。这些发现表明尿液蛋白表达模式可以预测狼疮性肾炎患者浸润肾的免疫细胞组成，并且主要分泌 IFN-γ 的 CD8+T 细胞可能是尿中免疫激活信号的关键贡献者。

结论：

在本项研究中，作者用 RayBiotech GSH-CAA-1000（可同时检测 1000 个人类细胞因子的半定量玻璃芯片）分析狼疮性肾炎患者尿液蛋白质组学，发现患者在 IFN-γ 诱导的趋化因子梯度上分层，更高值可能确定为增生性狼疮肾炎患者。尿液蛋白质组学与肾组织单细胞转录组学结合分析，发现尿中决定梯度的趋化因子主要由浸润的 CD8+T 细胞、自然杀伤细胞和髓样细胞产生。尿趋化因子梯度与肾浸润 CD8 + 细胞数显著相关。这些发现提示尿液蛋白质组学可反映狼疮性肾炎肾脏的生物学特性。患者病态特征可以在尿液中实时无创跟踪，实现诊断和个性化治疗。在整个研究中，蛋白质芯片发挥了至关重要的作用。