RayBiotech抗体芯片在肝癌研究中的应用

肝癌血清标志物筛选

杂志名称:  Cancer Letters
文献题目：Heat shock protein gp96 decreases p53 stability by regulating Mdm2 E3 ligase activity in liver cancer
本实验所用产品：RayBiotech人AAH-APO-1-2抗体芯片
（43个凋亡细胞因子抗体芯片）
实验样品：细胞裂解液

研究背景:
    肝癌的发生、肿瘤复发、对化疗放疗的抵抗都与肝癌细胞抵抗凋亡作用息息相关。本文揭示了热休克蛋白gp96在调节肝癌肿瘤细胞的生长和凋亡的潜在作用。筛查gp96基因敲除肝癌细胞中凋亡相关蛋白，发现p53有明显变化，过表达或者敲除gp96的实验都证明gp96可以降低p53蛋白的表达水平，且gp96调控细胞凋亡依赖于p53。进一步的实验证明gp96与p53和Mdm2的相互作用促进了Mdm2介导的p53的范素化和降解。并且，干扰gp96诱导了肝癌细胞的凋亡抑制肿瘤生长。本文阐明一个潜在的机制gp96通过增加MDM2的E3连接酶活性促进p53降解，为肝癌提供新的治疗策略。
研究思路
1 实验方法
1.1 样品准备
  两个肝癌细胞系(SK-Hep-1和 HepG2)；
  正常肝细胞系(L02)；
  基因敲除得到稳定的gp96 knock-down细胞系
1.2 RayBiotech凋亡抗体芯片检测gp96基因敲除后肝癌细胞系的凋亡蛋白表达差异；
1.3 细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖实验；
1.4 免疫共沉淀检测相互作用蛋白；
1.5 体外P53蛋白范素化检测；
1.6 鼠肿瘤移植实验； 
2 结果
2.1 Gp96抑制细胞凋亡以及降低肝癌细胞p53的表达
  
  
2 .2 RayBiotech芯片筛查肝癌细胞gp96基因敲除后凋亡相关蛋白变化
 
采用Ray Biotech AAH-APO-1的凋亡抗体芯片筛查gp96基因敲除和未敲除肝癌细胞凋亡相关蛋白表达差异，筛选到15个蛋白Caspase 3， DR6，bad，bax，IGFBP-5，IGFBP-6, IGF1-sR, HSP27，p21，p53，bcl2，bcl-w，CD40L, TRAILR-1，TRAILR-2在基因敲除细胞中明显上调，Fold Change 大于1.5倍。  用WB验证得到一致结果。
 
 
  
 2.3  gp96调控细胞凋亡依赖于p53

 
2.4 免疫共沉淀实验证明gp96与p53和Mdm2有相互作用
2.5 小鼠肿瘤移植实验证明gp96促进肿瘤体内生长
 
 

 
3 本文使用的RayBiotech AAH-APO-1 凋亡抗体芯片
 

bad	bax	bcl-2	bcl-w	BID
BIM	Caspase-3	Caspase-8	CD40 (TNFRSF5)	CD40 Ligand (TNFSF5)
cIAP-2	Cytochrome C	DR6 (TNFRSF21)	Fas (TNFRSF6/Apo-1)	Fas Ligand (TNFSF6)
HSP27	HSP60	HSP70	HTRA2	IGF-1
IGF-2	IGFBP-1	IGFBP-2	IGFBP-3	IGFBP-4
IGFBP-5	IGFBP-6	IGF-1 R	livin	p21
p27	p53	SMAC	Survivin (BIRC5)	TNF RI (TNFRSF1A)
TNF RII (TNFRSF1B)	TNF alpha	TNF beta (TNFSF1B)	TRAIL R1 (TNFRSF10A/DR4)	TRAIL R2 (TNFRSF10B/DR5)
TRAIL R3 (TNFRSF10C)	TRAIL R4 (TNFRSF10D)	XIAP